伊丽莎白诞生于伦敦的格林尼治普雷森希宫，她是亨利八世和他的第二个王后安妮·博林唯一幸存的孩子。由于她父母是按新教教规结婚的，天主教认为她是一个私生女。她出生时被指定为王位继承人，她的同父异母的姐姐玛丽成为她的服侍者。伊丽莎白三岁时，她的母亲被判叛逆罪处死，一年后亨利八世和他的第三个王后简·西摩就生了一个男孩：爱德华。伊丽莎白和玛丽都成了爱德华的佣人。
亨利后来的王后们对这两个公主都很好，亨利本人也经常关注她们的成长，她们受到很好的教育，有可靠的朋友和同龄的伴侣。1547年亨利死后，他最后的王后凯瑟琳·帕尔和她的新丈夫托马斯·西摩(他是简·西摩的兄弟，新国王爱德华六世的舅父)养护伊丽莎白。西摩被年轻的伊丽莎白所吸引，他夫人死后，他本来打算娶她为妇，但他和他的兄弟爱德华·西摩后来都在一系列权利斗争中被处死了。
伊丽莎白受到很好的教育，她的教师包括英国文艺复兴时期著名的人文主义者罗杰·阿斯坎。她受到古典、历史、数学、诗歌和语言的教育。在她统治期间她可以说和写六种语言：英语、法语、意大利语、西班牙语、拉丁语和希腊语。在凯瑟琳·帕尔和她的其他教师的影响下伊丽莎白成为了一个新教徒。
在她兄弟生前，她的地位比较稳定，但爱德华1553年就因肺结核或砒霜中毒而去世了。简·格雷夫人只做了九天女王，就被她家翁的同党推翻，并被其后上台的玛丽一世处死。玛丽是一个虔诚的天主教徒，她逼迫伊丽莎白改信天主教。伊丽莎白表面上虽然昄依，但内心仍然是一个新教徒。玛丽对此非常不满。有一小段时间里伊丽莎白甚至被关入伦敦塔。有人认为她是在这里认识了她后来的爱人莱斯特伯爵罗伯特·达德利的，但更可能的是他们在童年时代就相识了(罗伯特·达德利与女王不仅童年相识，两人还是同月同日生，当初伊丽莎白被关进伦敦塔时，罗伯特是为了追随她，与她一起被关进伦敦塔，所以，罗伯特之后被封为莱斯特伯爵也是与这密不可分的)。
伊丽莎白保了命，但玛丽与西班牙王国国王腓力二世的婚礼使得英格兰重归天主教的可能性增大了，对此英格兰人民及贵族都很不满。1558年玛丽无子而亡，伊丽莎白成了她的合法继承人。英国国会重申了亨利八世国王规定伊丽莎白作为继承人的安排。